Registration Dossier
Registration Dossier
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Please be aware that this old REACH registration data factsheet is no longer maintained; it remains frozen as of 19th May 2023.
The new ECHA CHEM database has been released by ECHA, and it now contains all REACH registration data. There are more details on the transition of ECHA's published data to ECHA CHEM here.
Diss Factsheets
Use of this information is subject to copyright laws and may require the permission of the owner of the information, as described in the ECHA Legal Notice.
EC number: 223-095-2 | CAS number: 3734-33-6
- Life Cycle description
- Uses advised against
- Endpoint summary
- Appearance / physical state / colour
- Melting point / freezing point
- Boiling point
- Density
- Particle size distribution (Granulometry)
- Vapour pressure
- Partition coefficient
- Water solubility
- Solubility in organic solvents / fat solubility
- Surface tension
- Flash point
- Auto flammability
- Flammability
- Explosiveness
- Oxidising properties
- Oxidation reduction potential
- Stability in organic solvents and identity of relevant degradation products
- Storage stability and reactivity towards container material
- Stability: thermal, sunlight, metals
- pH
- Dissociation constant
- Viscosity
- Additional physico-chemical information
- Additional physico-chemical properties of nanomaterials
- Nanomaterial agglomeration / aggregation
- Nanomaterial crystalline phase
- Nanomaterial crystallite and grain size
- Nanomaterial aspect ratio / shape
- Nanomaterial specific surface area
- Nanomaterial Zeta potential
- Nanomaterial surface chemistry
- Nanomaterial dustiness
- Nanomaterial porosity
- Nanomaterial pour density
- Nanomaterial photocatalytic activity
- Nanomaterial radical formation potential
- Nanomaterial catalytic activity
- Endpoint summary
- Stability
- Biodegradation
- Bioaccumulation
- Transport and distribution
- Environmental data
- Additional information on environmental fate and behaviour
- Ecotoxicological Summary
- Aquatic toxicity
- Endpoint summary
- Short-term toxicity to fish
- Long-term toxicity to fish
- Short-term toxicity to aquatic invertebrates
- Long-term toxicity to aquatic invertebrates
- Toxicity to aquatic algae and cyanobacteria
- Toxicity to aquatic plants other than algae
- Toxicity to microorganisms
- Endocrine disrupter testing in aquatic vertebrates – in vivo
- Toxicity to other aquatic organisms
- Sediment toxicity
- Terrestrial toxicity
- Biological effects monitoring
- Biotransformation and kinetics
- Additional ecotoxological information
- Toxicological Summary
- Toxicokinetics, metabolism and distribution
- Acute Toxicity
- Irritation / corrosion
- Sensitisation
- Repeated dose toxicity
- Genetic toxicity
- Carcinogenicity
- Toxicity to reproduction
- Specific investigations
- Exposure related observations in humans
- Toxic effects on livestock and pets
- Additional toxicological data
Genetic toxicity: in vitro
Administrative data
- Endpoint:
- in vitro cytogenicity / chromosome aberration study in mammalian cells
- Type of information:
- experimental study
- Adequacy of study:
- key study
- Reliability:
- 1 (reliable without restriction)
- Rationale for reliability incl. deficiencies:
- guideline study
- Justification for type of information:
- Data is from SSS study report
Data source
Reference
- Reference Type:
- study report
- Title:
- Unnamed
- Year:
- 2 017
- Report date:
- 2017
Materials and methods
Test guideline
- Qualifier:
- according to guideline
- Guideline:
- OECD Guideline 473 (In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test)
- Principles of method if other than guideline:
- This study was performed to identify whether the test item, Denatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6), causes any structural or numerical chromosomal aberrations (clastogenicity) in cultured human lymphocytes when exposed to both, with and without an exogenous metabolic activation using in vitro chromosomal aberration test in cultured human lymphocyte cell culture. The experiment was conducted following the OECD Guideline for the Testing of Chemicals 473.
- GLP compliance:
- yes
- Type of assay:
- other: in vitro chromosomal aberration test in cultured human lymphocyte cell culture
Test material
- Reference substance name:
- Denatonium benzoate
- EC Number:
- 223-095-2
- EC Name:
- Denatonium benzoate
- Cas Number:
- 3734-33-6
- Molecular formula:
- C21H29N2O.C7H5O2
- IUPAC Name:
- N-benzyl-2-[(2,6-dimethylphenyl)amino]-N,N-diethyl-2-oxoethanaminium benzoate hydrate
- Test material form:
- solid: granular
- Details on test material:
- - Name of test material: Denatonium benzoate
- Molecular formula: C21H29N2O.C7H5O2
- Molecular weight : 446.58 g/mol
- Substance type: organic
- Physical state: Solid
- SMILES: CCN{+}(CC)(Cc1ccccc1)(CC(=O)Nc1c(C)cccc1C).O{-}C(=O)c1ccccc1
Constituent 1
- Specific details on test material used for the study:
- - Name of test material: Denatonium benzoate
- IUPAC name: N-benzyl-2-[(2,6-dimethylphenyl)amino]-N,N-diethyl-2-oxoethanaminium benzoate hydrate
- Molecular formula: C21H29N2O.C7H5O2
- Molecular weight : 446.58 g/mol
- Substance type: organic
- Physical state: Solid
- SMILES: CCN{+}(CC)(Cc1ccccc1)(CC(=O)Nc1c(C)cccc1C).O{-}C(=O)c1ccccc1
Method
- Target gene:
- No data
Species / strainopen allclose all
- Species / strain / cell type:
- lymphocytes: Human
- Remarks:
- Short term treatment
- Details on mammalian cell type (if applicable):
- CELLS USED
- Source of cells: Young and healthy volunteers of age between 18-35 with no smoking and no recent illness records or recent exposures to genotoxic agents (e.g. chemicals, ionizing radiations) were selected as source of cells
- Suitability of cells: No data
- Cell cycle length, doubling time or proliferation index: No data
- Sex, age and number of blood donors if applicable: Sex: Male, Age: 18-35 yrs, Number of donors: 3
- Whether whole blood or separated lymphocytes were used if applicable: Separated lymphocytes were used for the study
- Number of passages if applicable: No data
- Methods for maintenance in cell culture if applicable: No data
- Modal number of chromosomes: No data
- Normal (negative control) cell cycle time: No data
MEDIA USED
- Type and identity of media including CO2 concentration if applicable: RPMI 1640 media
- Properly maintained: Yes
- Periodically checked for Mycoplasma contamination: No data
- Periodically checked for karyotype stability: No data
- Periodically 'cleansed' against high spontaneous background: No data - Additional strain / cell type characteristics:
- not specified
- Species / strain / cell type:
- lymphocytes: Human
- Remarks:
- Long term/ extended treatment
- Details on mammalian cell type (if applicable):
- CELLS USED
- Source of cells: Young and healthy volunteers of age between 18-35 with no smoking and no recent illness records or recent exposures to genotoxic agents (e.g. chemicals, ionizing radiations) were selected as source of cells
- Suitability of cells:
- Cell cycle length, doubling time or proliferation index: No data
- Sex, age and number of blood donors if applicable: Sex: Male, Age: 18-35 yrs, Number of donors: 3
- Whether whole blood or separated lymphocytes were used if applicable: Separated lymphocytes were used for the study
- Number of passages if applicable: No data
- Methods for maintenance in cell culture if applicable: No data
- Modal number of chromosomes: No data
- Normal (negative control) cell cycle time: No data
MEDIA USED
- Type and identity of media including CO2 concentration if applicable: RPMI 1640 media
- Properly maintained: Yes
- Periodically checked for Mycoplasma contamination: No data
- Periodically checked for karyotype stability: No data
- Periodically 'cleansed' against high spontaneous background: No data - Additional strain / cell type characteristics:
- not specified
- Cytokinesis block (if used):
- No data
- Metabolic activation:
- with and without
- Metabolic activation system:
- S9 mix
- Test concentrations with justification for top dose:
- 0, 0.313, 0.625 or 1.25 mg/mL
- Vehicle / solvent:
- - Vehicle(s)/solvent(s) used: RPMI-1640 medium
- Justification for choice of solvent/vehicle: The test chemical was soluble in RPMI-1640 medium
Controls
- Untreated negative controls:
- yes
- Remarks:
- Sterilized water
- Negative solvent / vehicle controls:
- not specified
- True negative controls:
- not specified
- Positive controls:
- yes
- Positive control substance:
- cyclophosphamide
- mitomycin C
- Details on test system and experimental conditions:
- METHOD OF APPLICATION: in medium
- Cell density at seeding (if applicable): 300 mitotic cells
DURATION
- Preincubation period:
- Exposure duration: Short term treatment: 3 hrs
Long term/ extended treatment: 48 hrs
- Expression time (cells in growth medium): 96 hrs approx
- Selection time (if incubation with a selection agent): No data
- Fixation time (start of exposure up to fixation or harvest of cells): 96 hrs approx
SELECTION AGENT (mutation assays): No data
SPINDLE INHIBITOR (cytogenetic assays): Colchicine
STAIN (for cytogenetic assays): 5% Giemsa stain
NUMBER OF REPLICATIONS: Duplicate
METHODS OF SLIDE PREPARATION AND STAINING TECHNIQUE USED: The slides were labeled and processed using ice cold methanol for fixation. A drop of resuspended cell was added to the slide (inclined approximately 45° angle) from a distance of approximately, 1 meter. To attain uniform spread of smear, the slide was gently titled. The slides were air dried and stained using 5% Giemsa stain. The stained slides were air dried and mounted using DPX mountant. The slides were coded (before scoring) and decoded (after scoring) by a technical person who was not involved in the study. Duplicate slides were used per treatment. Cells with structural chromosomal aberration(s) including and excluding gaps were scored. Breaks and gaps, Chromatid and chromosome type aberrations was recorded separately and classified by sub-types like breaks and exchanges.
NUMBER OF CELLS EVALUATED: No data
NUMBER OF METAPHASE SPREADS ANALYSED PER DOSE (if in vitro cytogenicity study in mammalian cells): A minimum of 300 well spread metaphases were scored per single culture
CRITERIA FOR MICRONUCLEUS IDENTIFICATION: No data
DETERMINATION OF CYTOTOXICITY
- Method: mitotic index; cloning efficiency; relative total growth; other: Mitotic index
- Any supplementary information relevant to cytotoxicity:
MI (%) = Number of mitotic cells × 100
Total number of cells scored
OTHER EXAMINATIONS:
- Determination of polyploidy: Incidence of increase in polyploidy cells was recorded separately
- Determination of endoreplication: Incidence of increase in cells with endoreduplicated chromosomes was recorded separately
- Methods, such as kinetochore antibody binding, to characterize whether micronuclei contain whole or fragmented chromosomes (if applicable): No data
- OTHER: No data - Rationale for test conditions:
- No data
- Evaluation criteria:
- 1. Test item should be considered clearly positive by a concentration related and statistically significant increase in the incidence of aberrant cells for the treatment group compared with the concurrent negative control group.
2. Test item should be considered clearly negative when no concentration related and statistically significant increase in the incidence of aberrant cells for the treatment group compared with the concurrent negative control group.
3. When the results do not meet the criteria specified for a positive or negative response shall be considered as an equivocal.
4. Incidence of increase in number of polyploidy cells may be considered which indicates test substance have potential to inhibit mitotic process and also numerical aberrations. Increase in number of cells with endoreduplicated chromosomes may indicate test substances have potential to inhibit cell cycle progress.
5. All results should be inside the distribution of historical control data (e.g. Poisson based 95% control limits). - Statistics:
- Data were expressed in mean ± SD. The data was analyzed with ANOVA test using Sigmaplot. Statistical analysis was performed to identify the mean difference between the control and treated groups. P value <0.05 was fixed as significance criterion.
Results and discussion
Test resultsopen allclose all
- Species / strain:
- lymphocytes: Human
- Remarks:
- Short term treatment
- Metabolic activation:
- with and without
- Genotoxicity:
- negative
- Cytotoxicity / choice of top concentrations:
- no cytotoxicity
- Vehicle controls validity:
- not specified
- Untreated negative controls validity:
- valid
- Positive controls validity:
- valid
- Species / strain:
- lymphocytes: Human
- Remarks:
- Extended / long-term treatment
- Metabolic activation:
- without
- Genotoxicity:
- negative
- Cytotoxicity / choice of top concentrations:
- no cytotoxicity
- Vehicle controls validity:
- not specified
- Untreated negative controls validity:
- valid
- Positive controls validity:
- valid
- Additional information on results:
- TEST-SPECIFIC CONFOUNDING FACTORS
- Effects of pH: No data
- Effects of osmolality: No data
- Evaporation from medium: No data
- Water solubility: No data
- Precipitation: No precipitation was observed
- Definition of acceptable cells for analysis: No data
- Other confounding effects: No data
RANGE-FINDING/SCREENING STUDIES: Five test item concentrations were selected initially for dose or concentration range finding (5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313 mg/ml ). Concentrations for the main study were selected based on the level of cytotoxicity (reduction of 45±5% of mitotic index) in the dose or concentration range finding study. Duplicates treatments were used for both, dose range finding and main study.
For concentration range finding (cytotoxcity) study, a total of 12 test tubes were taken. 10 for the five test item concentration selected and two for negative control. Each test tube containing a volume of 0.8 ml of anti coagulated human blood was added with 9 ml of complete RPMI 1640 media with the presence of mitogen (PHA) of 0.2 ml volume to induce the cell division. The lymphocytes were allowed to culture for 48 h in shaker water bath at 37°C at 70 rpm. The cultured cells were exposed to test item and further incubated at 37°C for 48 h in shaker water bath at 70 rpm. Following incubation, the tubes were centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and 5 ml of pre-warmed 0.075M KCl solution was added to the pellet and incubated at 37°C for 30 minutes. The tubes were centrifuged and the supernatant was discarded. The tubes were centrifuged by adding 5 ml of Carnoy’s fixative solution till the pellet colour turns white or creamy colour. 90% of the supernatant was discarded without disturbing the pellet. The pellet was re-suspended in the remaining supernatant for slide preparation and scoring of mitotic index (MI).
Cytotoxicity was observed at 5 and 2.5 mg/ml concentration with mean mitotic index value of 14.1 and 17.6 when compared with negative control. Cytotoxicity was determined using mitotic index with a value of 54.0 at test concentration 1.25 mg/ml when compared with negative control. No cytotoxicity was observed at 1.25, 0.625 and 0.313 mg/ml concentration levels. Hence, 1.25mg/ml was selected as the highest concentration for the main study.
CYTOKINESIS BLOCK (if used)
- Distribution of mono-, bi- and multi-nucleated cells: No data
NUMBER OF CELLS WITH MICRONUCLEI
- Number of cells for each treated and control culture: No data
- Indication whether binucleate or mononucleate where appropriate: No data
HISTORICAL CONTROL DATA (with ranges, means and standard deviation and confidence interval (e.g. 95%)
- Positive historical control data:
- Negative (solvent/vehicle) historical control data:
ADDITIONAL INFORMATION ON CYTOTOXICITY:
- Measurement of cytotoxicity used: Mitotic index
- Other observations when applicable: No data - Remarks on result:
- other: No mutagenic potential
Any other information on results incl. tables
MITOTIC INDEX FORRANGEFINDING STUDY
Treatment |
Slide code |
Total No. of cells |
Total No. of mitotic cells |
Mean mitotic index (%) |
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Sterilized water |
R-NC-1 |
1000 |
882 |
86.9 |
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R-NC-2 |
1000 |
856 |
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Denatonium benzoate 0.313mg/ml |
R-TC1-1 |
1000 |
714 |
72.2 |
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R-TC1-2 |
1000 |
730 |
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Denatonium benzoate0.625mg/ml |
R-TC2-1 |
1000 |
622 |
61.8 |
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R-TC2-2 |
1000 |
613 |
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Denatonium benzoate1.25mg/ml |
R-TC3-1 |
1000 |
542 |
54.0 |
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R-TC3-2 |
1000 |
538 |
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Denatonium benzoate2.5mg/ml |
R-TC4-1 |
1000 |
289 |
27.6 |
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R-TC4-2 |
1000 |
263 |
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Denatonium benzoate5mg/ml |
R-TC5-1 |
1000 |
138 |
14.1 |
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R-TC5-2 |
1000 |
144 |
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R- Range finding; NC- Negative control; TC- Test concentration; -1,-2- R MITOTIC INDEX FORMAINSTUDYShort term treatment (withoutS9)
Short term treatment (withS9)
Extended treatment (WithoutS9)
|
Applicant's summary and conclusion
- Conclusions:
- Denatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) was considered non-cytotoxic and non clastogenic at 1.25mg/ml for in vitro chromosomal aberration test and has no clastogenicity effect on human lymphocyte cells under the experimental conditions.
- Executive summary:
This study was performed to identify whether the test item, Denatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6), causes any structural or numerical chromosomal aberrations (clastogenicity) in cultured human lymphocytes when exposed to both, with and without an exogenous metabolic activation using in vitro chromosomal aberration test in cultured human lymphocyte cell culture.The experiment was conducted following the OECD Guideline for the Testing of Chemicals 473.
Clastogenicity ofDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6)was conducted in cultured human lymphocytes with negative control (0 mg/ml) and positive control.Five test item concentrations (5, 2.5, 1.25, 0.625 and 0.313 mg/ml)were selected for concentration range finding study to determine the cytotoxicity. Cytotoxicity was determined using mitotic index with a value of 54.0 at test concentration 1.25 mg/ml when compared withnegative control (0 mg/ml).Denatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) at5 mg/ml and 2.5 mg/ml was found to be cytotoxic with mean mitotic index value of 14.1 and 17.6 when compared withnegative control (0 mg/ml).Denatonium benzoate (CAS No. 3734‑33-6) at1.25, 0.625 and 0.313 mg/mlwere selected as the concentrations for the main study. Duplicate lymphocyte cultures were used for both, concentration range finding and main study. Sterilized water is used asnegative control, and positive controls such as Mitomycin C (0.5 µg/ml) for without S9 and Cyclophosphamide (3 µg/ml) for with S9 were used, respectively.
Human lymphocytes were cultured in RPMI-1640 media and exposed toDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6)and reference items both, with and without S9. The experiment was designed to expose human lymphocyte cells to short term (with and without metabolic activation (S9)) and long term or extended (without metabolic activation) treatment. In short term treatment, human lymphocyte cells were treated in the presence and absence of S9 mix for 3 h. After 3 h, old medium was replenished with fresh medium and harvested for 48 h. In extended treatment, human lymphocyte cells were continuously exposed to theDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6)and reference items for 48 h. At the end of cell cycle (45 h), Colchicine was added to arrest the cell division at metaphase. Cells were harvested and stained using 5% Giemsa stain and then analyzed microscopically for cytotoxicity and the presence of 300 metaphase cells to assess the clastogenicity (numerical and structural chromosomal aberrations).
In short term treatment without S9, the total number of chromosomal aberration was observed 1 in negative control; 97 in positive control (Mitomycin C - 0.5µg/ml); 11 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) at1.25mg/ml; 9 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) at0.625mg/ml; and 5 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734‑33‑6) at0.313mg/ml. No statistically significant difference total number of chromosomal aberration was observed in test concentrations at 1.25, 0.625, 0.313 mg/mlwhen compared withnegative control (0 mg/ml). The percentage of chromosomal aberration was found high in Mitomycin C (0.5µg/ml) 9.250% when compared with negative control(0 mg/ml).
In short term treatment with S9, the total number of chromosomal aberration was observed 4 in negative control; 100 in positive control (Cyclophosphamide - 3µg/ml); 9 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) at1.25mg/ml; 8 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) at0.625mg/ml; and 4 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) at0.313mg/ml. No statistically significant difference in total number of chromosomal aberration was observed in test concentrations at 1.25, 0.625, 0.313 mg/mlwhen compared withnegative control (0 mg/ml). The percentage of aberration was found high in Cyclophosphamide (3µg/ml) 9.583% when compared withnegative control (0 mg/ml).
In extended treatment without S9, the total number of chromosomal aberration was observed 6 in negative control (sterilized water); 108 in positive control (Mitomycin C - 0.5µg/ml); 11 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) at1.25mg/ml; 9 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6)at 0.625mg/ml; and 6 inDenatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6)at 0.313mg/ml. No statistically significant difference in total number of chromosomal aberration was observed in test concentrations at 1.25, 0.625, 0.313 mg/mlwhen compared withnegative control (0 mg/ml). The percentage of aberration was found to be high in Mitomycin C (0.5µg/ml) 9.000% when compared with negative control(0 mg/ml).
Ring aberration observed in test and control groups is insignificant and common. However, the ring aberration in test or treatment group is not because of the test item. Positive control results obtained was as expected and fell within the range, confirming the sensitivity of the test system, the effectiveness of the S9 mix, and the validity of the assay.
From the above results, concentration dependent increase in chromosomal aberration frequency was observed in all the three (1.25, 0.625, 0.313 mg/ml) concentrations of Denatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6). However, there was no statistical significant difference in the chromosomal aberration frequency was observed between the negative control (0 mg/ml) and all three concentrations of Denatonium benzoate (CAS No. 3734‑33-6) at 1.25, 0.625, 0.313 mg/ml. Based on the observations, it is concluded that Denatonium benzoate (CAS No. 3734-33-6) was considered to be non-clastogenic at 1.25 mg/ml.
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